前期准备工作
将完全培养基、PBS 缓冲液提前 30 分钟放置在 37℃水浴锅中预热，让试剂温度与细胞培养环境温度一致，减少温度刺激对细胞造成的损伤。
准备好 15mL 离心管、T25 或 T75 培养瓶（根据复苏细胞量来选择，若复苏细胞量较少，T25 培养瓶更为合适；若复苏细胞量较多或者后续需要大量培养，可选用 T75 培养瓶）、移液枪及无菌枪头。
开启生物安全柜，使用 75% 酒精擦拭操作台，随后进行 20 分钟的紫外消毒，营造无菌操作环境，防止微生物污染细胞。
复苏关键步骤
从液氮罐中迅速取出冻存管，快速放入 37℃水浴中，持续轻轻晃动，务必在 1 - 2 分钟内使细胞悬液完全融化，避免冰晶残留对细胞造成物理性损伤。
用 75% 酒精对冻存管外壁进行全面消毒后，将其移入生物安全柜。把细胞悬液缓慢注入含有 5mL 预热培养基的离心管中，以 1000rpm 的转速离心 5 分钟，离心结束后弃去上清液，从而去除冻存液中的 DMSO，因为 DMSO 对细胞有一定毒性。
用 2mL 完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，将重悬后的细胞接种至 T25 培养瓶，再补加培养基至 5mL，轻轻摇匀，让细胞均匀分布在培养瓶中。将培养瓶水平放置于培养箱内，24 小时内禁止移动，便于细胞贴壁。
复苏后观察要点
复苏 24 小时后，在显微镜下观察细胞状态。若细胞贴壁情况良好，呈现多边形上皮样，排列紧密，说明复苏较为成功，此时更换新鲜培养基，去除死亡细胞及残留杂质。
若贴壁率低于 50%，可延长至 48 小时再换液，在此期间尽量减少对培养瓶的移动和观察，为细胞提供稳定的贴壁环境。
把握传代时机
当 MHCC97H 细胞融合度达到 70% - 80% 时，就需要及时进行传代。如果细胞过度融合，会引发接触抑制，影响细胞的增殖活性，一般每 2 - 3 天需要关注细胞融合度，判断是否达到传代标准。
详细传代步骤
弃去培养瓶中的旧培养基，用 3mL PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞 2 次，彻底去除残留血清，因为血清中的成分会抑制胰酶活性，对细胞消化效果产生影响。
向培养瓶中加入 1mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，轻轻晃动培养瓶，使胰酶均匀覆盖细胞层，将培养瓶放入 37℃培养箱进行消化，消化时间通常在 3 - 4 分钟。但由于不同品牌胰酶活性存在差异，实际操作时需要在显微镜下密切观察，当细胞边缘收缩、间隙增大、部分细胞呈圆形悬浮，并且有部分细胞自然滑落时，立即加入 2mL 完全培养基终止消化。
用移液枪反复轻柔吹打瓶壁，将细胞吹打成单细胞悬液，动作要轻柔，避免产生大量气泡，以免损伤细胞。将细胞悬液收集至离心管，以 1000rpm 转速离心 5 分钟，弃去上清液。
按照 1:3 - 1:5 的比例（可根据细胞实际增殖速度适当调整，若细胞增殖较快，可采用较大传代比例；若增殖较慢，则采用较小传代比例），用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的培养瓶（如 T75 培养瓶，添加 10 - 15mL 培养基）。接种后轻轻摇匀，放回培养箱继续培养，并准确记录传代日期和代数。建议传代不超过 40 代，防止细胞特性发生漂移，影响实验结果的准确性。
冻存液配制
推荐两种冻存液配方：
92% FBS + 8% DMSO，该配方能为细胞提供丰富的营养物质，而且 DMSO 可以有效降低细胞内冰晶的形成，保护细胞。
92% 完全培养基 + 8% DMSO，同样能够满足细胞冻存的需求。冻存液需要现配现用，并放置在冰上预冷，减少对细胞的损伤。
冻存具体流程
选取处于对数生长期、状态良好的细胞，按照传代步骤进行消化和离心。
用预冷的冻存液重悬细胞，将细胞密度调整至 2×10⁶ - 5×10⁶ cells/mL，保证冻存细胞具有足够的活性和数量。
将细胞悬液分装至无菌冻存管，每管 1mL，在冻存管上清晰标记细胞名称、代数、冻存日期等信息。
采用程序降温法：先把冻存管放入 4℃冰箱放置 30 分钟，让细胞适应温度初步降低；再转移至 - 20℃冰箱放置 2 小时；随后放入 - 80℃冰箱过夜；最后转入液氮罐长期保存。如果没有程序降温盒，可以将冻存管放入泡沫盒（泡沫盒能起到一定的缓冲降温作用，不使用的话细胞复苏活率低），4℃静置 5 - 10 分钟，再移至 - 20℃静置 2 小时后转入 - 80℃过夜，次日转入液氮保存。液氮罐中应按区域存放冻存管，定期检查并补充液氮，确保液位始终覆盖冻存管，维持低温环境。
售后服务
重发标准
(1）细胞运输问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养瓶严重漏液，冻存管内容物已融化；
(2）细胞污染问题，收到细胞7天内，发现细胞污染问题，经核实无误；
(3）细胞生长问题，收到细胞7天内，发现细胞不增殖，经核实无误。
不予重发
(1）收到细胞时间超过7天以上的；
(2）使用非我们推荐的细胞完培；
(3）细胞培养时经过其他处理导致细胞出现问题的；
(4）客户操作失误导致的细胞污染、细胞状态不好的；
(5）细胞冻存后再复苏的细胞；
(6）未能提供真实清晰细胞培养前3天的细胞状态照片。
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