前期准备工作
将完全培养基、PBS 缓冲液提前 30 分钟放置在 37℃水浴锅中预热,让试剂温度与细胞培养环境温度一致,减少温度刺激对细胞造成的损伤。
准备好 15mL 离心管、T25 或 T75 培养瓶(根据复苏细胞量来选择,若复苏细胞量较少,T25 培养瓶更为合适;若复苏细胞量较多或者后续需要大量培养,可选用 T75 培养瓶)、移液枪及无菌枪头。
开启生物安全柜,使用 75% 酒精擦拭操作台,随后进行 20 分钟的紫外消毒,营造无菌操作环境,防止微生物污染细胞。
复苏关键步骤
从液氮罐中迅速取出冻存管,快速放入 37℃水浴中,持续轻轻晃动,务必在 1 - 2 分钟内使细胞悬液完全融化,避免冰晶残留对细胞造成物理性损伤。
用 75% 酒精对冻存管外壁进行全面消毒后,将其移入生物安全柜。把细胞悬液缓慢注入含有 5mL 预热培养基的离心管中,以 1000rpm 的转速离心 5 分钟,离心结束后弃去上清液,从而去除冻存液中的 DMSO,因为 DMSO 对细胞有一定毒性。
用 2mL 完全培养基轻柔重悬细胞沉淀,将重悬后的细胞接种至 T25 培养瓶,再补加培养基至 5mL,轻轻摇匀,让细胞均匀分布在培养瓶中。将培养瓶水平放置于培养箱内,24 小时内禁止移动,便于细胞贴壁。
复苏后观察要点
复苏 24 小时后,在显微镜下观察细胞状态。若细胞贴壁情况良好,呈现多边形上皮样,排列紧密,说明复苏较为成功,此时更换新鲜培养基,去除死亡细胞及残留杂质。
若贴壁率低于 50%,可延长至 48 小时再换液,在此期间尽量减少对培养瓶的移动和观察,为细胞提供稳定的贴壁环境。
把握传代时机
当 MHCC97H 细胞融合度达到 70% - 80% 时,就需要及时进行传代。如果细胞过度融合,会引发接触抑制,影响细胞的增殖活性,一般每 2 - 3 天需要关注细胞融合度,判断是否达到传代标准。
详细传代步骤
弃去培养瓶中的旧培养基,用 3mL PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞 2 次,彻底去除残留血清,因为血清中的成分会抑制胰酶活性,对细胞消化效果产生影响。
向培养瓶中加入 1mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液,轻轻晃动培养瓶,使胰酶均匀覆盖细胞层,将培养瓶放入 37℃培养箱进行消化,消化时间通常在 3 - 4 分钟。但由于不同品牌胰酶活性存在差异,实际操作时需要在显微镜下密切观察,当细胞边缘收缩、间隙增大、部分细胞呈圆形悬浮,并且有部分细胞自然滑落时,立即加入 2mL 完全培养基终止消化。
用移液枪反复轻柔吹打瓶壁,将细胞吹打成单细胞悬液,动作要轻柔,避免产生大量气泡,以免损伤细胞。将细胞悬液收集至离心管,以 1000rpm 转速离心 5 分钟,弃去上清液。
按照 1:3 - 1:5 的比例(可根据细胞实际增殖速度适当调整,若细胞增殖较快,可采用较大传代比例;若增殖较慢,则采用较小传代比例),用新鲜培养基重悬细胞,接种至新的培养瓶(如 T75 培养瓶,添加 10 - 15mL 培养基)。接种后轻轻摇匀,放回培养箱继续培养,并准确记录传代日期和代数。建议传代不超过 40 代,防止细胞特性发生漂移,影响实验结果的准确性。
冻存液配制
推荐两种冻存液配方:
92% FBS + 8% DMSO,该配方能为细胞提供丰富的营养物质,而且 DMSO 可以有效降低细胞内冰晶的形成,保护细胞。
92% 完全培养基 + 8% DMSO,同样能够满足细胞冻存的需求。冻存液需要现配现用,并放置在冰上预冷,减少对细胞的损伤。
冻存具体流程
选取处于对数生长期、状态良好的细胞,按照传代步骤进行消化和离心。
用预冷的冻存液重悬细胞,将细胞密度调整至 2×10⁶ - 5×10⁶ cells/mL,保证冻存细胞具有足够的活性和数量。
将细胞悬液分装至无菌冻存管,每管 1mL,在冻存管上清晰标记细胞名称、代数、冻存日期等信息。
采用程序降温法:先把冻存管放入 4℃冰箱放置 30 分钟,让细胞适应温度初步降低;再转移至 - 20℃冰箱放置 2 小时;随后放入 - 80℃冰箱过夜;最后转入液氮罐长期保存。如果没有程序降温盒,可以将冻存管放入泡沫盒(泡沫盒能起到一定的缓冲降温作用,不使用的话细胞复苏活率低),4℃静置 5 - 10 分钟,再移至 - 20℃静置 2 小时后转入 - 80℃过夜,次日转入液氮保存。液氮罐中应按区域存放冻存管,定期检查并补充液氮,确保液位始终覆盖冻存管,维持低温环境。
售后服务
重发标准
(1)细胞运输问题,如细胞丢失、瓶身破损、培养瓶严重漏液,冻存管内容物已融化;
(2)细胞污染问题,收到细胞7天内,发现细胞污染问题,经核实无误;
(3)细胞生长问题,收到细胞7天内,发现细胞不增殖,经核实无误。
不予重发
(1)收到细胞时间超过7天以上的;
(2)使用非我们推荐的细胞完培;
(3)细胞培养时经过其他处理导致细胞出现问题的;
(4)客户操作失误导致的细胞污染、细胞状态不好的;
(5)细胞冻存后再复苏的细胞;
(6)未能提供真实清晰细胞培养前3天的细胞状态照片。
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