Min6 小鼠胰岛β细胞株
准备工作
将恒温水浴锅预热至 37℃。
预热 DMEM 高糖培养基（添加 15% 胎牛血清、71.5μM β - 巯基乙醇、1% 青霉素 - 链霉素）。
准备 75cm² 培养瓶、移液管、离心机、PBS 缓冲液。
细胞复苏
从液氮罐中取出冻存的 Min6 细胞管，迅速放入 37℃水浴锅，1 分钟内完全解冻。
用 75% 酒精消毒冻存管外部，转移细胞悬液至含 10ml 预热培养基的离心管。
1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。
用 5ml 完全培养基重悬细胞沉淀，转移至 75cm² 培养瓶，补加培养基至 10ml，轻轻摇匀。
将培养瓶置于 37℃、5% CO₂培养箱培养。
后续处理
24 小时后首次换液，去除冻存保护剂。
之后每 2 天换液一次，观察细胞生长状态。
准备工作
预热 DMEM 高糖培养基、0.05% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液、PBS 缓冲液。
准备新的培养瓶、移液管、离心机。
细胞消化
当细胞融合度达 70% - 80% 时，弃去旧培养基。
用 5ml PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞两次。
加入 2ml 0.05% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，37℃消化 1 - 2 分钟，显微镜下观察细胞变圆脱落时终止消化。
终止消化与传代
加入 3ml 完全培养基终止胰蛋白酶活性，轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落形成单细胞悬液。
转移细胞悬液至离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。
用适量完全培养基重悬细胞，按 1:3 - 1:4 比例传代接种，放回培养箱。
准备工作
配制细胞冻存液（含 20% 胎牛血清、10% DMSO 的 DMEM 高糖培养基），冰上预冷。
准备冻存管、程序降温盒、液氮罐。
细胞收集
选取对数生长期、状态良好的细胞，按传代步骤消化离心。
用预冷冻存液重悬细胞，调整密度至 1×10⁶ - 5×10⁶/ml。
梯度冻存
将细胞悬液分装冻存管，每管 1ml。
放入程序降温盒， - 80℃冰箱过夜后转入液氮罐。
或采用分步降温：4℃ 30 分钟、 - 20℃ 2 小时、 - 80℃过夜、液氮罐保存。
售后服务
重发标准
(1）细胞运输问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养瓶严重漏液，冻存管内容物已融化；
(2）细胞污染问题，收到细胞7天内，发现细胞污染问题，经核实无误；
(3）细胞生长问题，收到细胞7天内，发现细胞不增殖，经核实无误。
不予重发
(1）收到细胞时间超过7天以上的；
(2）使用非我们推荐的细胞完培；
(3）细胞培养时经过其他处理导致细胞出现问题的；
(4）客户操作失误导致的细胞污染、细胞状态不好的；
(5）细胞冻存后再复苏的细胞；
(6）未能提供真实清晰细胞培养前3天的细胞状态照片。
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