准备工作
将恒温水浴锅预热至 37℃。
把 RPMI - 1640 完全培养基（添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素）置于 37℃环境中预热。
准备好 75cm² 培养瓶、移液管、离心机、PBS 缓冲液以及酒精灯等物品。
细胞复苏
从液氮罐中取出冻存的 hTERT - HPNE 细胞管，迅速将其放入 37℃水浴锅中，并不停晃动，使细胞在 1 分钟内完全解冻。
用 75% 酒精对冻存管外部进行消毒，然后将细胞悬液转移至含有 10ml 预热培养基的离心管中。
以 1000rpm 的转速离心 5 分钟，之后弃去上清液。
用 5ml 完全培养基重悬细胞沉淀，接着将细胞悬液转移到 75cm² 培养瓶中，再补充培养基至 10ml，轻轻摇匀。
将培养瓶置于 37℃、5% CO₂的培养箱中进行培养。
后续处理
接种后的 24 小时进行首次换液，以此去除冻存保护剂。
之后每隔 2 - 3 天换液一次，换液时观察细胞的生长状态和密度。
准备工作
预热 RPMI - 1640 完全培养基、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液以及 PBS 缓冲液。
准备好新的培养瓶、移液管、离心机等器材。
细胞消化
当细胞融合度达到 80% - 90% 时，弃去旧的培养基。
用 5ml PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞两次，以去除残留的血清。
向培养瓶中加入 2ml 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，然后将培养瓶置于 37℃培养箱中消化 1 - 2 分钟。消化过程中要在显微镜下密切观察，当细胞开始变圆并脱落时，立即终止消化。
终止消化与传代
加入 3ml 完全培养基终止胰蛋白酶的活性，用移液管轻轻吹打瓶壁，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。
将细胞悬液转移至离心管，以 1000rpm 离心 5 分钟，随后弃去上清液。
用适量的完全培养基重悬细胞，按照 1:3 - 1:4 的比例进行传代接种，最后将培养瓶放回培养箱继续培养。
准备工作
配制细胞冻存液（含有 20% 胎牛血清、10% DMSO 的 RPMI - 1640 培养基），并将其置于冰上预冷。
准备好冻存管、程序降温盒（内装异丙醇，提前放入 - 20℃冰箱预冷）以及液氮罐。
细胞收集
选取处于对数生长期且状态良好的细胞，按照传代操作中的步骤进行消化和离心。
用预冷的冻存液重悬细胞，调整细胞密度至 1×10⁶ - 5×10⁶/ml。
梯度冻存
将细胞悬液分装到冻存管中，每管 1ml。
把冻存管放入程序降温盒，先置于 - 80℃冰箱过夜，之后转移至液氮罐中长期保存。
也可以采用分步降温的方法：先在 4℃放置 30 分钟，再在 - 20℃放置 2 小时，接着在 - 80℃放置过夜，最后转入液氮罐。
培养条件
hTERT - HPNE 细胞需要在 37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，并且要使用添加 10% 胎牛血清和 1% 双抗的 RPMI - 1640 培养基。
该细胞属于贴壁细胞，在进行换液和传代操作时，动作要轻柔，避免损伤细胞。
污染防控
所有操作都应在生物安全柜中进行，严格遵守无菌操作规范。
定期对培养箱进行消毒，可使用 75% 酒精擦拭，并进行紫外照射。
要密切观察细胞的形态和生长情况，一旦发现污染迹象，如培养基浑浊、出现细菌或真菌菌落等，应立即处理污染细胞。
细胞特性
hTERT - HPNE 细胞是永生化的正常胰腺导管上皮细胞，在培养过程中可能会出现一定程度的分化。为了维持细胞的特性，传代次数不宜超过 50 代。
冻存复苏后的细胞可能需要 1 - 2 次传代才能恢复最佳生长状态。
售后服务
重发标准
(1）细胞运输问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养瓶严重漏液，冻存管内容物已融化；
(2）细胞污染问题，收到细胞7天内，发现细胞污染问题，经核实无误；
(3）细胞生长问题，收到细胞7天内，发现细胞不增殖，经核实无误。
不予重发
(1）收到细胞时间超过7天以上的；
(2）使用非我们推荐的细胞完培；
(3）细胞培养时经过其他处理导致细胞出现问题的；
(4）客户操作失误导致的细胞污染、细胞状态不好的；
(5）细胞冻存后再复苏的细胞；
(6）未能提供真实清晰细胞培养前3天的细胞状态照片。
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