名称：HepG2人肝癌细胞
细胞培养操作
前期准备
将完全培养基、PBS 缓冲液置于 37℃水浴锅预热 30 分钟
准备 15mL 离心管、T25/T75 培养瓶（根据复苏细胞量选择）、移液枪及无菌枪头
生物安全柜内用 75% 酒精擦拭操作台，紫外消毒 20 分钟
复苏操作
从液氮罐中取出冻存管，迅速投入 37℃水浴，持续轻轻晃动至 1-2 分钟内完全融化（避免冰晶残留损伤细胞）
冻存管外壁用 75% 酒精消毒后移入安全柜，将细胞悬液缓慢注入含 5mL 预热培养基的离心管
1000rpm 离心 5 分钟，弃上清（去除冻存液中的 DMSO）
用 2mL 完全培养基重悬细胞沉淀，接种至 T25 培养瓶，补加培养基至 5mL，轻轻摇匀使细胞均匀分布
培养瓶平放于培养箱，24 小时内禁止移动，以利细胞贴壁
复苏后观察
24 小时后镜检，若细胞贴壁良好（呈多边形上皮样，排列紧密），更换新鲜培养基（去除死亡细胞）
若贴壁率低于 50%，可延长至 48 小时再换液，期间避免频繁观察
细胞传代操作
传代时机
当细胞融合度达到70%-80% 时传代（避免过度融合导致接触抑制，影响增殖活性），一般每 2-3 天传代一次。
操作步骤
弃去旧培养基，用 3mL PBS 轻柔冲洗细胞 2 次（去除残留血清，避免影响胰酶活性）
加入 1mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，37℃孵育 1-2 分钟，镜下观察至细胞边缘收缩、间隙增大、呈圆形悬浮
立即加入 2mL 完全培养基终止消化，用移液枪反复吹打瓶壁（动作轻柔，避免产生气泡），使细胞形成单细胞悬液
收集悬液至离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清
按1:3-1:5 比例（根据增殖速度调整），用新鲜培养基重悬细胞，接种至新培养瓶（T75 培养瓶加 10-15mL 培养基）
摇匀后放回培养箱，记录传代日期和代数（建议传代不超过 40 代，防止细胞特性漂移）
细胞冻存操作
冻存液配制
采用90% 完全培养基 + 10% DMSO（现配现用，冰上预冷），DMSO 需为细胞培养级（避免杂质毒性）。
冻存步骤
选取对数生长期、状态良好的细胞，按传代步骤消化离心
用预冷冻存液重悬细胞，调整密度至2×10⁶-5×10⁶ cells/mL
分装至无菌冻存管（每管 1mL），标记细胞名称、代数、日期
采用程序降温：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 2 小时→-80℃过夜→转入液氮罐长期保存（或直接使用程序降温盒）
液氮罐中按区域存放，定期补充液氮（液位需覆盖冻存管）
售后服务
重发标准
(1）细胞运输问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养瓶严重漏液，冻存管内容物已融化；
(2）细胞污染问题，收到细胞7天内，发现细胞污染问题，经核实无误；
(3）细胞生长问题，收到细胞7天内，发现细胞不增殖，经核实无误。
不予重发
(1）收到细胞时间超过7天以上的；
(2）使用非我们推荐的细胞完培；
(3）细胞培养时经过其他处理导致细胞出现问题的；
(4）客户操作失误导致的细胞污染、细胞状态不好的；
(5）细胞冻存后再复苏的细胞；
(6）未能提供真实清晰细胞培养前3天的细胞状态照片。
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