预热 RPMI-1640 完全培养基（含 10% FBS、1% 双抗）至 37℃，准备 75cm² 培养瓶、15mL 离心管、移液枪及枪头。
紫外照射超净台 30 分钟，开启通风系统，用 75% 酒精擦拭台面及双手。
从液氮罐中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴锅中，轻轻晃动至完全融化（约 1-2 分钟）。
用 75% 酒精消毒冻存管外壁，转移至超净台内。
将细胞悬液转移至含 9mL 预热培养基的 15mL 离心管中，1000rpm 离心 5 分钟。
弃上清，用 5mL 新鲜培养基重悬细胞沉淀，转移至 75cm² 培养瓶中，补加培养基至 10mL。
轻轻晃动培养瓶使细胞均匀分布，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养。
培养 24 小时后更换培养基，去除残留 DMSO 和死细胞。
显微镜下观察细胞贴壁情况及形态，正常情况下细胞 2-3 天可达到 70%-80% 融合度。
当细胞融合度达到 70%-80% 时进行传代，避免过度融合导致细胞老化或分化。
吸弃旧培养基，用 2-3mL PBS 轻轻冲洗细胞两次，去除残留血清。
加入 1mL 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（覆盖细胞层），置于培养箱消化 1-2 分钟（镜下观察细胞收缩变圆即可）。
加入 2mL 完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞（从瓶底边缘向中心吹打），确保细胞完全脱落并分散为单细胞悬液。
将细胞悬液转移至 15mL 离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。
用新鲜培养基重悬细胞，按 1:3-1:5 比例接种至新培养瓶，补加培养基至适当体积（如 T25 瓶加 5mL，T75 瓶加 15mL）。
消化时间不宜过长，避免损伤细胞；若消化困难，可适当延长时间或提高胰酶浓度。
吹打力度要轻柔，避免产生气泡导致细胞破裂。
现配含 10% DMSO、90% FBS 的冻存液（如 1mL DMSO + 9mL FBS），置于冰上预冷。
按传代步骤消化并离心收集细胞，用预冷的冻存液重悬细胞，调整密度至 1×10⁶-1×10⁷ cells/mL。
将细胞悬液分装至冻存管（每管 1mL），标记细胞名称、代数、日期等信息。
先将冻存管放入 4℃冰箱 30 分钟，再转移至 - 20℃冰箱 2 小时，最后放入 - 80℃冰箱过夜（或使用程序降温盒）。
次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
将细胞消化后制成单细胞悬液，按 5000-10000 cells/well 接种于 96 孔板（每孔 100μL），设 3-6 个复孔。
培养 24 小时使细胞贴壁。
弃原培养基，加入含不同浓度药物的培养基（每孔 100μL），设对照组（含 0.1% DMSO 的培养基）。
继续培养 24-72 小时（根据实验目的选择时间点）。
每孔加入 10μL MTT 溶液（5mg/mL），继续孵育 4 小时。
吸弃上清，每孔加入 100μL DMSO，振荡 10 分钟溶解结晶。
用无血清培养基稀释 Matrigel（1:8），每孔加入 50μL 铺于 Transwell 小室上室底面，37℃孵育 3-4 小时使其凝固。
消化细胞并用无血清培养基洗涤两次，调整细胞密度至 5×10⁵ cells/mL。
上室加入 200μL 细胞悬液（含 1×10⁵ cells），下室加入 600μL 含 10% FBS 的培养基作为趋化因子。
培养 24-48 小时（根据细胞侵袭能力调整时间）。
取出小室，弃上清，用 PBS 洗两次，棉签擦去上室未侵袭细胞。
4% 多聚甲醛固定 30 分钟，0.1% 结晶紫染色 20 分钟，水洗后晾干。
随机选取 5 个高倍视野（×200），显微镜下计数侵袭到下室的细胞数，取平均值。
定期（每月 1 次）检测细胞是否污染支原体，可使用 PCR 法或荧光染色法。
若污染支原体，建议丢弃细胞或使用支原体清除试剂处理。
PSN-1 细胞建议使用代数在 P10-P30 之间，避免长期传代导致的细胞特性改变。
操作时佩戴手套、口罩，穿实验服，避免接触细胞培养液及分泌物。
废弃的细胞及培养液需经 121℃高压灭菌 30 分钟后处理。
每次传代或实验前观察细胞形态（如是否出现空泡、脱落等异常），并记录生长曲线。
首次复苏后及时冻存至少 10 管细胞，确保实验材料的一致性和稳定性。
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